《北京市醫(yī)療器械無菌試驗(yàn) 檢查要點(diǎn)指南（2023版）》修訂說明

時間：2023-08-29 來源：作者：

為了貫徹落實(shí)《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》及相關(guān)配套文件要求，加強(qiáng)北京市醫(yī)療器械生產(chǎn)科學(xué)監(jiān)管，指導(dǎo)和規(guī)范北京市醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)監(jiān)督檢查工作，幫助檢查人員增強(qiáng)對醫(yī)療器械無菌試驗(yàn)的認(rèn)識，明確對企業(yè)醫(yī)療器械無菌試驗(yàn)的基本要求，北京市藥監(jiān)局結(jié)合相關(guān)法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)變化情況，以及北京市監(jiān)管工作實(shí)際，組織對《醫(yī)療器械無菌試驗(yàn)檢查要點(diǎn)指南》（2010版）進(jìn)行了修訂。

一、修訂背景

醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)主要依據(jù)為《中華人民共和國藥典》（以下簡稱“藥典”），藥典現(xiàn)行有效版本為2020版，其中無菌檢驗(yàn)相關(guān)內(nèi)容較2010版有較大差異，為與藥典內(nèi)容保持一致，同時參照相關(guān)管理規(guī)范和國行標(biāo)的要求，修訂原有文件。

二、修訂思路

　結(jié)合相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)要求的變化，以及北京市醫(yī)療器械無菌試驗(yàn)監(jiān)管實(shí)際，對原指南有關(guān)內(nèi)容進(jìn)一步修改完善，有效落實(shí)醫(yī)療器械法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)要求，對北京市醫(yī)療器械無菌試驗(yàn)相關(guān)監(jiān)管工作進(jìn)行科學(xué)指導(dǎo)，全力提升科學(xué)監(jiān)管工作水平。

三、主要修訂內(nèi)容

此次修訂，主要對以下內(nèi)容進(jìn)行了修改和完善：

（一）無菌檢查有關(guān)要求

根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，將無菌檢查環(huán)境潔凈度要求由“10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域”修改為“隔離器系統(tǒng)或B級背景下的A級單向流潔凈區(qū)域”；陽性對照管培養(yǎng)時間由“48~72小時”修改為“不超過5天”。

（二）涉及培養(yǎng)基有關(guān)要求

根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，針對培養(yǎng)基的種類、保存期、培養(yǎng)基制備及適用性檢查要求進(jìn)行了修訂。如對培養(yǎng)基種類由“改良馬丁培養(yǎng)基”修改為“胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基”；對制備好的培養(yǎng)基增加了需進(jìn)行保存期驗(yàn)證的要求；刪除了改良馬丁培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制方法，增加了胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄液體培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基等的配制方法；硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的接菌種類由“金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和生孢梭菌”修改為“金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和生孢梭菌”；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（替代“改良馬丁培養(yǎng)基”）的接菌種類由“白色念珠菌和黑曲霉”修改為“枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉”等等。

（三）無菌試驗(yàn)培養(yǎng)及觀察

試驗(yàn)觀察要求由“逐日觀察”修改為“定期觀察”；對培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁后的后續(xù)轉(zhuǎn)種要求做了修改；對培養(yǎng)基制備記錄增加了需記錄滅菌后培養(yǎng)基pH值的要求；無菌試驗(yàn)原始記錄中增加了需記錄所使用培養(yǎng)基批號的要求等。

（四）方法適用性試驗(yàn)

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的接菌種類由“金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和生孢梭菌”修改為“金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和生孢梭菌”；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（替代“改良馬丁培養(yǎng)基”）的接菌種類由“白色念珠菌和黑曲霉”修改為“枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉”。

（五）供試品相關(guān)要求

供試品數(shù)量由“應(yīng)滿足同一批號3~11個單位供試品”修改為“應(yīng)滿足標(biāo)準(zhǔn)中對于檢驗(yàn)樣品數(shù)量的要求”，以滿足國標(biāo)修訂的要求；檢驗(yàn)量的定義由“一次試驗(yàn)所用的供試品總量（g/mL）”修改為“供試品每個最小包裝接種至每份培養(yǎng)基的最小量”；按照2020版藥典重新修訂了“表1批出廠產(chǎn)品最少量檢驗(yàn)數(shù)量”、“表2上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量”和“表3供試品的最少檢驗(yàn)量”的內(nèi)容。

（六）名詞解釋

根據(jù)最新管理規(guī)范和國標(biāo)要求，對常見的名詞解釋內(nèi)容進(jìn)行了修訂，并對正文中涉及到的關(guān)鍵術(shù)語增加了相應(yīng)名詞解釋。

北京市醫(yī)療器械無菌試驗(yàn)檢查

要點(diǎn)指南（2023版）

（征求意見稿）

無菌檢驗(yàn)是無菌醫(yī)療器械產(chǎn)品生產(chǎn)控制過程中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。其檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果判定及檢驗(yàn)人員業(yè)務(wù)能力等因素直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。作為無菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)，其無菌檢驗(yàn)工作應(yīng)由本企業(yè)獨(dú)立完成。

本指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管人員增強(qiáng)對無菌檢驗(yàn)相關(guān)知識的認(rèn)識，指導(dǎo)和規(guī)范全市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管人員對醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)無菌檢驗(yàn)過程控制水平的監(jiān)督檢查工作，同時，為醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)（以下簡稱生產(chǎn)企業(yè)）在無菌檢驗(yàn)的過程管理要求提供參考和依據(jù)。

本指南中引用的國家相關(guān)法規(guī)、規(guī)章、標(biāo)準(zhǔn)、檢查指南等版本發(fā)生變化時，要以執(zhí)行的最新版為準(zhǔn)。必要時，北京市藥品監(jiān)督管理局應(yīng)重新研究修訂，以確保本指南持續(xù)符合要求。

一、適用范圍

本檢查指南可作為北京市藥品監(jiān)督管理局組織、實(shí)施醫(yī)療器械注冊質(zhì)量管理體系現(xiàn)場核查、《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》現(xiàn)場核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督檢查等涉及無菌檢驗(yàn)檢查的參考資料。

二、檢查內(nèi)容

檢查人員應(yīng)在充分了解生產(chǎn)企業(yè)無菌檢驗(yàn)活動的情況下，對其無菌檢驗(yàn)過程的控制水平進(jìn)行客觀的檢查和評價。

一般情況下，檢查人員可按照以下順序開展檢查工作，并適時做好相關(guān)記錄：

1．了解產(chǎn)品特性及生產(chǎn)企業(yè)選擇的無菌檢驗(yàn)方法。常見的產(chǎn)品無菌檢查法包括直接接種法和薄膜過濾法。當(dāng)建立產(chǎn)品的無菌檢查方法時，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以證明所采用的方法能夠給出正確的結(jié)果。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時，應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。方法適用性試驗(yàn)應(yīng)按供試品無菌檢查的規(guī)定及有關(guān)要求進(jìn)行操作，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性和對微生物無毒性。應(yīng)對藥典規(guī)定的每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行方法確認(rèn)。方法適用性試驗(yàn)也可與供試品的無菌檢查同時進(jìn)行。

2．了解檢驗(yàn)人員的專業(yè)背景、培訓(xùn)情況及工作經(jīng)歷�？赏ㄟ^查看學(xué)歷證書、培訓(xùn)證書或當(dāng)面詢問檢驗(yàn)人員的方式，檢查無菌檢驗(yàn)人員是否具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)。

3．現(xiàn)場察看無菌實(shí)驗(yàn)室。無菌檢查應(yīng)在隔離器系統(tǒng)或B級背景下的A 級單向流潔凈區(qū)域中進(jìn)行，A級和B級區(qū)域的空氣供給應(yīng)通過終端高效空氣過濾器（HEP A）。其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期監(jiān)測。

4．現(xiàn)場察看無菌試驗(yàn)所需的設(shè)備和器具。其中，主要設(shè)備包括：恒溫培養(yǎng)箱（真菌、細(xì)菌）和（或）恒溫水浴箱、壓力蒸汽滅菌器和（或）電熱干燥箱、電子天平、光學(xué)顯微鏡、集菌儀、過濾裝置（無油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子）等；從試驗(yàn)安全性考慮，建議陽性對照試驗(yàn)使用生物安全柜。

主要器具有：試管及試管架、酒精燈、75%乙醇棉、滅菌刻度吸管（1mL）、滅菌平皿（9cm）、錐形瓶、三角燒瓶、滅菌剪刀、鑷子等。

生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)采用可靠方法對與供試液接觸的所有器具滅菌，通常置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃、30分鐘，或置電熱干燥箱內(nèi)160℃、2小時。器具滅菌后必須做好標(biāo)識，標(biāo)明滅菌的時間和使用有效期。器皿在滅菌后，最多1周即用完。

5．對照生產(chǎn)企業(yè)有關(guān)無菌試驗(yàn)的管理制度、操作規(guī)程等相關(guān)技術(shù)文件，要求檢驗(yàn)人員當(dāng)場操作或口述無菌檢驗(yàn)的過程。

（1）培養(yǎng)基制備

生產(chǎn)企業(yè)可按藥典中的處方制備培養(yǎng)基，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2℃～25℃、避光的環(huán)境，并在經(jīng)驗(yàn)證的保存期內(nèi)使用。

生產(chǎn)企業(yè)也可以使用商品化的預(yù)制培養(yǎng)基，應(yīng)在規(guī)定的有效期內(nèi)使用。

無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進(jìn)行。

（2）供試品的無菌檢查

無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法相同。

無菌操作時，如果供試品容器內(nèi)有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內(nèi)導(dǎo)入無菌空氣，再按無菌操作啟開容器取出內(nèi)容物。

（3）培養(yǎng)及觀察

含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應(yīng)定期觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液不少于1mL轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，將原始培養(yǎng)物和新接種的培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)不少于4天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。

（4）結(jié)果判斷

生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷：

①若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；②若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無效，即生長的微生物非供試品所含。陽性對照管應(yīng)生長良好，陰性對照管不得有菌生長，否則試驗(yàn)無效。

當(dāng)符合下列至少一個條件時，方可判試驗(yàn)結(jié)果無效：①無菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求；②回顧無菌試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；③供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。

試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。重試時，重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。

6．查閱試驗(yàn)記錄。完整的試驗(yàn)記錄應(yīng)明確包含下列幾類信息：

（1）樣品記錄，至少應(yīng)包括：取樣日期、樣品名稱、樣品規(guī)格、樣品批號、取樣地點(diǎn)、取樣方式、取樣人、原始試驗(yàn)記錄序號。

（2）滅菌物品制備記錄

①培養(yǎng)基：培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)基批號、各組分的稱取量（g）、蒸餾水用量（mL）、培養(yǎng)基分裝數(shù)量、滅菌日期、滅菌的實(shí)際溫度和時間、滅菌后pH值（冷卻至25℃測定，不得超過規(guī)定值的±0.2）、制備人、培養(yǎng)基存放地點(diǎn)和有效期等。

②器具：器具名稱、器具數(shù)量、滅菌日期、滅菌的實(shí)際溫度和時間、制備人、器具存放地點(diǎn)、有效期等。

（3）原始試驗(yàn)記錄，至少應(yīng)包括：記錄名稱、記錄序號、樣品名稱、樣品規(guī)格、樣品批號、滅菌批號、樣品數(shù)量、取樣日期、檢驗(yàn)日期、檢驗(yàn)依據(jù)、主要試驗(yàn)設(shè)備及器具、使用的培養(yǎng)基批號、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)環(huán)境條件、試驗(yàn)結(jié)果（定期觀察的結(jié)果）、試驗(yàn)結(jié)論、檢測人、復(fù)核人等。

（4）廢棄物處理記錄，至少應(yīng)包括：廢棄物形態(tài)（固體、液體）、廢棄物數(shù)量、滅菌時間和溫度、經(jīng)辦人、處理日期等。

三、其它應(yīng)注意的問題

1．生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)確保樣品具有代表性：試驗(yàn)樣品應(yīng)從常規(guī)產(chǎn)品中能夠代表加工過程和條件的批中選擇。選擇樣品是隨機(jī)的。試驗(yàn)樣品的選擇和試驗(yàn)前預(yù)處理方式應(yīng)明確，以免對樣品上所含的微生物的數(shù)量和種類造成污染和改變。試驗(yàn)樣品可以選擇制造過程中的不合格產(chǎn)品，它們應(yīng)該代表這個生產(chǎn)批的加工程序和條件。用于試驗(yàn)的不合格產(chǎn)品應(yīng)不會影響無菌測試的有效性。

2．生產(chǎn)企業(yè)對于供試品的選取、轉(zhuǎn)移過程要采取防止污染措施，確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。選取制作供試品的試驗(yàn)樣品時，樣品包裝須完好無損，尤其是只有一層包裝的樣品。進(jìn)入無菌檢驗(yàn)室的樣品若有兩層（或兩層以上）包裝的，需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆除后，傳入實(shí)驗(yàn)室。

3．無菌檢驗(yàn)中接觸供試品的試驗(yàn)用具溫度不能過高，以防供試品上可能存在的微生物因溫度過高被滅活。對不同種類和不同批次的產(chǎn)品，在拆包裝及夾取樣品時，應(yīng)更換試驗(yàn)用具（如：剪刀、鑷子）。

4．進(jìn)入無菌操作室的所有培養(yǎng)基、供試品等的外表都應(yīng)采用適用的方法進(jìn)行消毒處理（如：紫外燈照射不少于30分鐘；適用時，對供試品外包裝表面用適宜的消毒液進(jìn)行徹底消毒等），以避免將外包裝污染的微生物帶入無菌檢驗(yàn)室。出具試驗(yàn)結(jié)果后，所有培養(yǎng)物須經(jīng)121℃高壓滅菌30分鐘的處理。

5．由于無菌檢驗(yàn)時間跨度較長，因此記錄應(yīng)能夠完整體現(xiàn)試驗(yàn)的全過程，對于在試驗(yàn)過程中出現(xiàn)的各種情況，均應(yīng)在記錄中客觀反映。

6. 在進(jìn)行無菌檢驗(yàn)時，還應(yīng)考慮消除產(chǎn)生假陰性的因素。產(chǎn)生假陰性的因素以及相應(yīng)的消除措施包括：培養(yǎng)條件不能支持微生物的生長，應(yīng)按照藥典要去進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查；產(chǎn)品中含有某種抑菌成分會導(dǎo)致微生物生長微弱、緩慢或不生長，可采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基用量、使用中和劑或滅活劑等方式消除抑菌物質(zhì)的影響；產(chǎn)品滅菌后未進(jìn)行充分的解析（如采用環(huán)氧乙烷滅菌）導(dǎo)致微生物被殺死，應(yīng)確定滅菌后產(chǎn)品的解析時間、儲存條件及儲存時間。

參考資料一：

常見的名詞解釋

1．滅菌：經(jīng)確認(rèn)的使產(chǎn)品無存活微生物的過程。目前國際上規(guī)定，滅菌過程必須使物品污染微生物存活概率減少到10^-6及以下。

2．微生物：在顯微鏡下才能看到的微小實(shí)體，包括細(xì)菌、真菌、原生動物和病毒。

3．無菌技術(shù)：是指在微生物試驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施，其中包括無菌環(huán)境設(shè)施、無菌試驗(yàn)器材以及無菌操作。

4．無菌操作：是指在無菌環(huán)境條件下，在對無菌制品或無菌器械進(jìn)行檢驗(yàn)的過程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。

5．培養(yǎng)條件：促進(jìn)微生物復(fù)蘇、生長和（或）繁殖所采用的生長培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法的組合，培養(yǎng)方法可包括溫度、時間和其他規(guī)定用于培養(yǎng)的條件。

6．需氧微生物：需要氧氣進(jìn)行代謝的微生物。

7．厭氧微生物：不需要氧氣進(jìn)行代謝的微生物。

8．抑細(xì)菌/抑霉菌試驗(yàn)：用選定的微生物來演示某些物質(zhì)的存在能夠抑制這些微生物的繁殖。

9．促生長試驗(yàn)：為了證明一種培養(yǎng)基能夠支持微生物繁殖而進(jìn)行的技術(shù)操作。

10．假陰性：實(shí)際陽性的無菌試驗(yàn)結(jié)果被變成了陰性。

11．假陽性：實(shí)際陰性的無菌試驗(yàn)結(jié)果被變成了陽性。

12．生物指示物：對規(guī)定的滅菌過程有特定的抗力，含有活微生物的測試系統(tǒng)。

13．化學(xué)指示物：根據(jù)暴露于某一滅菌過程所產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化，顯現(xiàn)一個或多個預(yù)定過程變量變化的測試系統(tǒng)。

14．無菌保證水平（SAL）：滅菌后產(chǎn)品上存在單個活微生物的概率。

15.表面活性劑：改變?nèi)芤罕砻婺埽ū砻鎻埩Γ┑某煞帧?span lang="EN-US">

16.中和劑：有抑菌成分中和能力的化學(xué)有效成分。

17.滅活劑：對抑菌成分有滅活能力的化學(xué)有效成分。

18.潔凈區(qū)：需要對環(huán)境中塵粒及微生物數(shù)量進(jìn)行控制的房間（區(qū)域），其建筑結(jié)構(gòu)、裝備及其使用應(yīng)當(dāng)能夠減少該區(qū)域內(nèi)污染物的引入、產(chǎn)生和滯留。

19. A級潔凈區(qū)：高風(fēng)險操作區(qū)，如灌裝區(qū)、放置膠塞桶和與無菌制劑直接接觸的敞口包裝容器的區(qū)域及無菌裝配或連接操作的區(qū)域，應(yīng)當(dāng)用單向流操作臺（罩）維持該區(qū)的環(huán)境狀態(tài)。單向流系統(tǒng)在其工作區(qū)域必須均勻送風(fēng)，風(fēng)速為0.36-0.54m/s（指導(dǎo)值）。應(yīng)當(dāng)有數(shù)據(jù)證明單向流的狀態(tài)并經(jīng)過驗(yàn)證。在密閉的隔離操作器或手套箱內(nèi)，可使用較低的風(fēng)速。B級潔凈區(qū)：指無菌配制和灌裝等高風(fēng)險操作A級潔凈區(qū)所處的背景區(qū)域。

各級別空氣懸浮粒子的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定如下表：

潔凈度級別	懸浮粒子最大允許數(shù)/立方米
	靜態(tài)		動態(tài)
	≥0.5μm	≥5.0μm	≥0.5μm	≥5.0μm
A級	3520	20	3520	20
B級	3520	29	352000	2900

參考資料二：

供試品數(shù)量的選擇

檢驗(yàn)數(shù)量是指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量，成品每亞批均應(yīng)進(jìn)行無菌檢查。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按中國藥典2020版四部通則1101中表1規(guī)定，上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)按表2規(guī)定。表1、表2中最少檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽性對照試驗(yàn)的供試品用量。執(zhí)行GB/T 14233.2的供試品數(shù)量應(yīng)滿足標(biāo)準(zhǔn)中對于檢驗(yàn)樣品數(shù)量的要求。

檢驗(yàn)量是指供試品每個最小包裝接種至每份培養(yǎng)基的最小量。除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種的供試品量按中國藥典2020版四部通則1101中表3規(guī)定。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。

表1 批出廠產(chǎn)品最少量檢驗(yàn)數(shù)量

供試品	批產(chǎn)量N（個）	接種每種培養(yǎng)基的最少檢驗(yàn)數(shù)量
注射劑	≤100 100＜N≤500 ＞500	10%或4個（取較多者） 10個 2%或20個（取較少者）
大體積注射劑（＞100mL）		2%或10個（取較少者）
眼用及其他非注射產(chǎn)品	≤200 ＞200	5%或2個（取較多者） 10個
桶裝無菌固體原料	≤4 4＜N≤50 ＞50	每個容器 20%或4個容器（取較多者） 2%或10個容器（取較多者）
醫(yī)療器械	≤100 100＜N≤500 ＞500	10%或4件（取較多者） 10件 2%或20件（取較少者）

注：若每個容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中最少檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)增加相應(yīng)倍數(shù)。

表2 上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量

供試品

供試品最少檢驗(yàn)數(shù)量

（瓶或支）

液體制劑

固體制劑

血液制品V＜50mL

V≥50mL

醫(yī)療器械

注：1.若每個容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中的最少檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)加倍增加相應(yīng)倍數(shù)。

2.桶裝固體原料的最少檢驗(yàn)數(shù)量為4個包裝。

表3 供試品的最少檢驗(yàn)量

供試品	供試品裝量	每支樣品接入每種培養(yǎng)基的最少量
液體制劑	V＜1mL 1mL≤V≤40mL 40mL＜V≤100mL V＞100mL	全量半量，但不得少于1mL 20mL 10%，但不得少于20 mL
固體制劑	M＜50mg 50mg≤M＜300mg 300mg≤M≤5g M＞5g	全量半量，但不得少于50mg 150mg 500mg
醫(yī)療器械	外科用敷料棉花及紗布	取100mg或1cm×3cm
	縫合線、一次性醫(yī)用材料	整個材料^①
	帶導(dǎo)管的一次性醫(yī)療器械（如輸液袋）	二分之一內(nèi)表面積
	其他醫(yī)療器械	整個器具^①（切碎或拆散開）

注：①如果醫(yī)療器械體積過大培養(yǎng)及用量可在2000mL以上，將其完全浸沒。

參考資料三：

培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)應(yīng)注意培養(yǎng)條件：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（30～35）℃14天；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（20～25）℃14天。選擇培養(yǎng)條件需考慮的因素：產(chǎn)品的性質(zhì)、制造方法、潛在的微生物污染來源、可能遇到的微生物種類。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基必須在煮沸后，再進(jìn)行分裝、滅菌。

1．硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基

胰酪胨 15.0g、酵母浸出粉 5.0g、葡萄糖/無水葡萄糖 5.5g/5.0g、氯化鈉 2.5g、L-胱氨酸 0.5g、新配制的0.1%刃天青溶液 1.0 mL、硫乙醇酸鈉 0.5g（或硫乙醇酸 0.3mL）、瓊脂 0.75g、水 1000 mL

除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH，使滅菌后在25℃的pH值為7.1±0.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的 1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/3 ，否則，須經(jīng) 100℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過 20 分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。

除另有規(guī)定外，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置（30～35）℃培養(yǎng)。

2．胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基

胰酪胨 17.0g、氯化鈉 5.0g、大豆木瓜蛋白酶水解物 3.0g、磷酸氫二鉀 2.5g、葡萄糖/無水葡萄糖 2.5g/2.3g、水 1000 mL

除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入葡萄糖，分裝，滅菌。

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置（20～25）℃培養(yǎng)。

3．中和或滅活用培養(yǎng)基

按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同方法適用性試驗(yàn)。

4．0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（用于硫酸鏈霉素等抗生素的無菌檢查）

胨 10.0g、氯化鈉 5.0g、牛肉浸出粉 3.0g、葡萄糖 5.0g、水 1000 mL

除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為 7.2±0.2，分裝，滅菌。

5．胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基

胰酪胨 15.0g、氯化鈉 5.0g、大豆木瓜蛋白酶水解物 5.0g、瓊脂 15.0g、水1000 mL

除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，搖勻，分裝，滅菌。

6．沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基

動物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g、葡萄糖 20.0g、水 1000 mL

除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2，加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。

7．沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基

動物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g、瓊脂15.0g、葡萄糖 40.0g、水 1000 mL

除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。

8．馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）

馬鈴薯(去皮) 200g、瓊脂 14.0g、葡萄糖 20.0g、水 1000 mL

取馬鈴薯，切成小塊，加水1000 mL，煮沸20~30分鐘，用6～8層紗布過濾，取濾液補(bǔ)水至1000 mL，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。
參考資料四：

培養(yǎng)基的適用性檢查

1．無菌性檢查

每批培養(yǎng)基一般隨機(jī)取不少于5支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。

2．靈敏度檢查

菌種：培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存和確認(rèn)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64 941]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]

3．菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，（30～35）℃培養(yǎng)18～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，（20～25）℃培養(yǎng)2～3天，上述培養(yǎng)物用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度菌懸液。

接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，（20～25）℃培養(yǎng)5～7天或直到獲得豐富的孢子，加入適量含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

菌懸液若在室溫下放置，一般應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在（2～8）℃可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在（2～8）℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。

4．培養(yǎng)基接種

取適宜裝量的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照；取適宜裝量的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種不大于100cfu 的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照。接種細(xì)菌的培養(yǎng)管培養(yǎng)時間不超過3天，接種真菌的培養(yǎng)管培養(yǎng)時間不得超過5天。

5．結(jié)果判定

空白對照管應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。

參考資料五：

方法適用性試驗(yàn)

1．菌種及菌液制備

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]的菌液制備同金黃色葡萄球菌。

2．薄膜過濾法

按供試品的無菌檢查要求，取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量，采用薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入不大于100cfu的試驗(yàn)菌，過濾。加培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)，接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌的濾筒內(nèi)加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基；接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的濾筒內(nèi)加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。

3．直接接種法

取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6管，分別接入不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基6管，分別接入不大于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管按供試品的無菌檢查要求，接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時間不得超過5天。

4．結(jié)果判斷

與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

方法適用性試驗(yàn)也可與供試品的無菌檢查同時進(jìn)行。

參考資料六：

供試品處理及接種培養(yǎng)基

直接接種法：每個供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15mL，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10mL。

薄膜過濾法：將供試液混勻，過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。沖洗后，如用封閉式薄膜過濾器，分別將100mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。

薄膜過濾法應(yīng)優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器，無菌檢查用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm。直徑約為50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。

參考資料七：

對照試驗(yàn)

1．陽性對照：陽性對照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。陽性對照試驗(yàn)的菌液制備同方法驗(yàn)證試驗(yàn)，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)不超過5天應(yīng)生長良好。

2．陰性對照：供試品無菌檢查時，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

3．稀釋液、沖洗液及其制備方法

稀釋液、沖洗液配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。

（1）0.1%無菌蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000mL，微溫溶解，必要時濾過使澄清，調(diào)節(jié)pH值至7.1±0.2，分裝，滅菌。

（2）pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液取磷酸二氫鉀3.56g，無水磷酸氫二鈉5.77g，氯化鈉4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000mL，微溫溶解，必要時濾過使澄清，分裝，滅菌。

（3）根據(jù)供試品的特性，可選用其他經(jīng)驗(yàn)證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。（如0.9%無菌氯化鈉溶液）

如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。

參考資料八：

參考資料

——《中華人民共和國藥典》

——GB/T 14233.2《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法第2部分生物學(xué)試驗(yàn)方法》

——GB 19489《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》

——GB 50346《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》

——GB/T 16292～16294《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子的測試方法》、《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測試方法》、《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》

——GB/T 19971《醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌術(shù)語》

——GB/T 19973.2《醫(yī)療器械的滅菌微生物學(xué)方法第2部分：用于滅菌過程的定義、確認(rèn)和維護(hù)的無菌試驗(yàn)》

——《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》附錄1 無菌藥品

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